Apa Alat Dasar yang Diperlukan untuk Menghasilkan Sel Inang Rekombinan?

Teknik yang dikembangkan pada awal 1970-an untuk isolasi, pemotongan dan penyambungan molekul DNA digunakan untuk rekayasa dan analisis molekul DNA dan RNA. Alat dasar yang diperlukan untuk menghasilkan sel inang rekombinan dijelaskan di bawah ini:

  1. Isolasi dan Pemurnian DNA :

Sel inang yang mengandung gen dengan fungsi yang diinginkan (seperti Pulau Langerhans pankreas yang mengeluarkan insulin) secara mekanis terganggu sehingga komponen intraseluler termasuk asam nukleat dapat dilepaskan.

DNA Dimurnikan dan dipulihkan menggunakan banyak teknik seperti sentrifugasi, elektroforesis, presipitasi, dll. Sifat komparatif dari kromosom virus, bakteri dan jamur diberikan.

‘Sistem modifikasi-pembatasan’ memberikan pertahanan pada bakteri. Ada dua komponen yang ada dalam sistem ini:

  1. Komponen pertama adalah enzim restriksi yang mengenali urutan DNA tertentu dan memotong setiap untai yang memiliki urutan tersebut. Istilah ‘pembatasan’ mengacu pada fungsinya karena membatasi DNA asing (dari bakteriofag) dan menurunkannya.
  2. Komponen kedua adalah sistem modifikasi yang mengubah urutan DNA bakteri yang dikenali oleh enzim restriksi fag, dengan menambahkan gugus metil ke satu atau dua nukleotida.

Oleh karena itu enzim restriksi gagal mengenali dan mendegradasi DNA bakteri yang dimodifikasi. Mengikuti mekanisme ini, bakteri melindungi kromosomnya sendiri dari degradasi oleh enzim restriksi yang berasal dari bakteriofag.

Jadi bakteri yang berbeda terdiri dari nuklease ujung restriksi yang berbeda dan sesuai dengan ini, metilase juga diproduksi.

Mb= juta pasangan basa; K=ribu; nt = nukleotida

  1. Enzim Pembatas – Gunting Molekul:

Enzim restriksi disebut sebagai ‘gunting molekuler’. Ini bertindak sebagai dasar teknologi rDNA. Enzim ini ada pada bakteri dan memberikan sejenis mekanisme pertahanan yang disebut ‘sistem modifikasi-pembatasan’. Basis molekuler dari sistem ini dijelaskan pertama kali oleh Werner Arber pada tahun 1965.

(a) Jenis Endonuklease Pembatasan:

Ada tiga jenis utama endonuklease restriksi. Ini ditetapkan sebagai Tipe I, Tipe II dan Tipe III. Setiap enzim sedikit berbeda dengan mode aksi yang berbeda. Tipe I dan Tipe D adalah kompleks multi-sub unit besar yang mengandung aktivitas endonuklease dan metilase.

(saya) Tipe I:

Enzim ini memotong DNA pada situs acak yang bisa lebih dari 1000 pasangan basa dari urutan pengenalan. Ini bergerak sepanjang DNA dalam reaksi dan membutuhkan Mg ++ , S-adenosil metionin dan ATP sebagai co-faktor.

(ii) Tipe II:

Jenis enzim restriksi ini pertama kali diisolasi oleh Hamilton Smith. Ini sederhana dan tidak memerlukan ATP untuk degradasi DNA. Mereka memotong DNA di dalam situs pengenalan. Daniel Nathans pertama kali menggunakan enzim ini untuk memetakan dan menganalisis gen dan genom.

(iii) Tipe III:

Kelompok endonuklease ini memotong DNA sekitar 25 pasangan basa dari urutan pengenalan. Dalam suatu reaksi, ia bergerak sepanjang DNA dan membutuhkan ATP sebagai sumber energi.

Enzim restriksi (I) Tipe II pertama yang diisolasi dan dikarakterisasi berasal dari Escherichia coli strain RY. Oleh karena itu, dinamakan sebagai EcoRl.

Dinamai dengan menggunakan huruf pertama genus, dua huruf spesies, satu strain dan satu angka Romawi untuk menunjukkan urutan penemuan enzim. Untuk penemuan enzim restriksi, W. Arber, H. Smith dan D. Nathans dianugerahi Hadiah Nobel pada tahun 1978.

(b) Pembelahan Urutan Pengakuan:

Ribuan enzim restriksi telah ditemukan dan beberapa di antaranya tersedia secara komersial. Dari tiga jenis endonuklease restriksi di atas, Tipe II digunakan dalam manipulasi gen.

Karena mereka dapat digunakan secara in vitro untuk memotong DNA pada tempat pengenalan yang biasanya memiliki panjang 4 sampai 8 pasangan basa dan bersifat palindromik. Panjang situs pengenalan enzim yang berbeda bervariasi. Berbagai jenis enzim restriksi Tipe II, sumber dan tempat pengenalannya diberikan pada Tabel 3.2.

(i) Enzim EcoRI berikatan dengan daerah yang memiliki urutan palindromik spesifik (di mana dua untai identik ketika keduanya dibaca dalam polaritas yang sama yaitu pada arah 5′-8′). Panjang daerah ini adalah 6 pasangan basa yaitu palindrom heksanukleotida.

Ini memotong antara residu G dan A dari setiap untai dan menghasilkan dua ujung potongan komplementer beruntai tunggal yang asimetris memiliki 5 ′ overhang dari 4 nukleotida. Ujung ini disebut ujung lengket atau ujung kohesif. Karena basa nukleotida daerah ini dapat berpasangan dan menempel

(ii) Di sisi lain ada beberapa enzim restriksi Tipe II lainnya yang memotong kedua untai DNA pada pasangan basa yang sama tetapi di tengah urutan pengenalan, dan menghasilkan fragmen DNA dengan ujung tumpul atau ujung rata. Misalnya Hae III (diisolasi dari Haemophilus aegypticus, ordo enzim

(III) Urutan palindromik panjang empat nukleotida dan memotong secara simetris kedua untai DNA dan membentuk ujung tumpul seperti di bawah ini:

(c) Konstruksi Molekul DNA Rekombinan:

Molekul DNA rekombinan dapat dihasilkan dengan memotong dua fragmen DNA yang berbeda dengan enzim restriksi yang sama dan mencampurkan fragmen tersebut menjadi satu.

Dua fragmen DNA yang berbeda bergabung bersama karena adanya ujung yang lengket (nukleotida beruntai tunggal yang identik) pada kedua fragmen yang berbeda.

(i) Polimorfisme Panjang Fragmen Pembatasan (RFLP):

DNA setiap organisme memiliki urutan spesifik yang dapat dibersihkan oleh beberapa enzim restriksi dan dapat diproduksi fragmen dengan panjang berbeda. Fragmen ini disebut fragmen restriksi.

Fragmen restriksi dari berbagai individu dan spesies bervariasi; ini memiliki panjang yang berbeda karena variasi dalam urutan DNA dari situs restriksi. Oleh karena itu, variasi ini disebut sebagai polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP).

Asumsikan bahwa ada dua individu A dan B. Pisahkan DNA genom mereka. Mencerna DNA mereka dengan menggunakan endonuklease restriksi ‘A’. Enzim ini membelah materi DNA menjadi 4 fragmen berbeda dengan panjang yang bervariasi karena tempat pengenalan enzim A bervariasi pada DNA.

Fragmen ini dipisahkan pada gel agarosa. Fragmen DNA yang berbeda dibentuk oleh RFLP pada gel. Teknik RFLP digunakan untuk membedakan antara fragmen DNA berbeda yang dicerna oleh enzim restriksi. Ini sangat berguna karena sidik jari DNA (profil cDNA atau pengetikan DNA) didasarkan pada teknik RFLP.

  1. Penggunaan Enzim Lain dalam Teknologi rDNA :

Ada banyak enzim lain juga yang digunakan dalam teknologi rDNA. Beberapa enzim penting diberikan di bawah ini:

(i) DNA polimerase I:

Ini mensintesis DNA yang saling melengkapi dengan templat DNA dalam arah 5′-8′. Itu tidak memiliki aktivitas eksokatalitik 5′-3′.

(ii) Eksonuklease III:

Itu membelah dari ujung DNA linier dan mencerna DNA beruntai ganda hanya dari ujung 3′.

(iii) Ligase DNA:

DNA ligase memiliki peran fisiologis dalam menyegel torehan untai tunggal pada DNA untai ganda. Ini membentuk ikatan fosfodiester antara dua nukleotida yang berdekatan. Ada dua jenis DNA ligase: E. coli DNA ligase (yang menggunakan NAD sebagai sumber energi) dan T4 DNA ligase (yang menggunakan ATP sebagai sumber energi).

(iv) Alkalin Fosfatase (AP):

Gugus 5’fosfat pada dasarnya diperlukan untuk ligasi fragmen DNA. Tetapi DNA tidak dapat diikat jika gugus 5′-fosfat dihilangkan.

Enzim AP menghilangkan gugus 5’fosfat dari ujung 5′ fragmen DNA dan membuatnya bebas. Enzim ini digunakan untuk memeriksa self-ligation DNA vektor di mana ada masalah resirkularisasi. Sumber AP adalah bakteri (BAP) atau usus betis (CAP).

(v) Transkripsi Balik:

Ini adalah polimerase DNA dependen RNA yang mensintesis DNA komplementer ke templat RNA dalam arah 5′->3′.

(vi) RNase A:

Ini adalah nuklease yang mencerna RNA tetapi bukan DNA.

(vii) Taq DNA Polimerase:

Ini adalah polimerase DNA yang diisolasi dari bakteri termofilik (Thermus aquaticus). Ini beroperasi pada 72°C tetapi stabil di atas 90°C. Enzim Taq digunakan dalam PCR.

(viii) Pengalihan Terminal:

Enzim ini menambahkan beberapa nukleotida ke ujung 3′ dari DNA atau RNA beruntai ganda atau linier.

(ix) SI Nuklease:

SI nuklease bekerja pada untaian tunggal DNA beruntai ganda dan menghasilkan ujung tumpul pada fragmen DNA.

  1. Kloning Vektor atau DNA Kendaraan :

Alat biologis utama lainnya dalam teknologi DNA rekombinan adalah vektor yang digunakan untuk mengirimkan DNA asing yang diinginkan ke dalam sel inang. Ini bertindak sebagai kendaraan atau pengangkut. Vektor harus memiliki ciri-ciri berikut saat bertindak sebagai kendaraan kloning.

(i) Harus mudah diisolasi dari organisme.

(ii) Ukurannya harus kecil karena molekul vektor DNA yang lebih besar sering rusak selama pemurnian.

Beberapa vektor telah dibangun secara artifisial yang dapat memenuhi kriteria di atas atau fitur yang diinginkan. Sebagian besar vektor adalah plasmid dan sisanya dibangun berdasarkan fag X dan Ml3. Contoh beberapa vektor kloning diberikan di

(a) Plasmid Bakteri:

Plasmid adalah molekul DNA ekstra-kromosom, bereplikasi sendiri, melingkar, terdampar ganda yang secara alami ditemukan di semua bakteri dan beberapa jamur. Plasmid dipertahankan dalam bakteri sebagai entitas independen.

Biasanya plasmid tidak mengambil bagian dalam pertumbuhan sel tetapi memberi beberapa sifat tambahan pada bakteri misalnya resistensi terhadap antibiotik tertentu (plasmid R), pemindahannya sendiri dari sel ke plasmid lain (F plasmid), pemanfaatan metabolit yang tidak biasa (plasmid degradatif), atau tidak fungsi yang jelas (cryptic plasmid).

Ukuran plasmid bervariasi dari 1 hingga 500 kilo pasangan basa. Mati rasa, dari plasmid per sel mungkin 1 sampai 4 salinan atau 10 sampai 100 salinan.

Umumnya, plasmid alami tidak memiliki beberapa fitur penting yang diperlukan untuk vektor kloning berkualitas tinggi (dijelaskan sebelumnya). Oleh karena itu, sesuai kebutuhan, plasmid dimodifikasi di laboratorium agar dapat berperan sebagai vektor kloning yang efisien.

Ada beberapa vektor kloning plasmid seperti pBR322, pSC102, ColEl, pUC, pRP4, pRK2, pRSFlOlO, pEY, pWWO, Ti- dan Ri-DNA plasmid, dll.

(i) Plasmid pBR322:

ThepBR322adalah vektor kloning plasmid tujuan umum yang paling sering digunakan. PBR320 berisi 4.361 pasangan basa.

Ini membawa dua gen resistensi antibiotik: tef memberikan resistensi terhadap tetrasiklin dan amp memberikan resistensi terhadap ampisilln. Beberapa situs restriksi untuk enzim restriksi terdapat pada plasmid. Ini juga memiliki situs asal untuk replikasi (ori) yang hanya berfungsi di E. coli.

(ii) Sequence (MCS) dimasukkan ke dalam gen lacZ tanpa mengganggu fungsi gen lain. MCS memiliki situs unik untuk beberapa endonuklease restriksi. Itu juga membawa satu gen ori E. coli. Plasmid ini bekerja pada prokariota.

(iii) Ti-Plamida:

Ini adalah plasmid alami dari tumor Agro bacterium. Itu dimodifikasi untuk bertindak sebagai vektor. Dengan menggunakan plasmid berbasis Ti-DNA beberapa tanaman transgenik telah dibangun. Ti-plasmid sangat besar mulai dari 150 hingga 200 kb. Peta fisik plasmid gurita (pTiB806) diberikan pada Gambar 3.4C.

(iv) Vektor Antar-Jemput:

Vektor prokariotik tidak dapat eksis dan bekerja dalam sel eukariotik. Oleh karena itu, telah dibangun beberapa vektor yang terdapat pada sel prokariotik (E. coli) dan eukariotik. Vektor tersebut memiliki dua asal untuk replikasi yaitu ori E dan ori Euk disebut ‘vektor shuttle’.

Ori E berfungsi dalam E. coli dan ori Euk berfungsi dalam sel eukariotik. Selain itu, vektor ini juga mengandung gen resistensi antibiotik (misalnya amp r ) yang bertindak sebagai penanda yang dapat dipilih.

Salah satu contoh shuttle vector adalah yeast episomal plasmid (YEP). YEP adalah vektor berbasis plasmid 2 lingkaran yang berisi asal replikasi 2 µ, urutan antar-jemput E. coli dan penanda yang dapat dipilih yaitu gen ragi Ieu2.

(v) Vektor Ekspresi:

Selain penggabungan gen yang diinginkan ke dalam sel inang, tujuan dari teknologi rDNA adalah untuk menghasilkan sejumlah besar protein yang dikodekan oleh sisipan DNA. Untuk mencapai tujuan ini, gen baru yang diperkenalkan harus diekspresikan.

Oleh karena itu, ekspresi gen kloning dilakukan dengan memasukkan ‘urutan promotor’ (sinyal untuk inisiasi transkripsi), dan ‘urutan terminator’ (yang memberikan sinyal untuk penghentian transkripsi). Dekat situs kloning urutan inisiasi terjemahan (situs pengikatan ribosom dan kodon pendek) juga dimasukkan ke dalam vektor.

Vektor kloning yang mengandung sinyal untuk sintesis protein ini disebut vektor ekspresi. Vektor ekspresi pSOMI yang mengandung promotor-operator (PO) untuk produksi rantai somatostatin (soml) diberikan dalam.

(b) Vektor Bakteriofag:

Bakteriofag adalah virus yang menginfeksi sel bakteri setelah menyuntikkan bahan genetiknya (DNA atau RNA) dan membunuhnya. DNA virus bereplikasi dan berekspresi di dalam sel bakteri, dan menghasilkan sejumlah partikel fag yang dilepaskan setelah menghancurkan sel bakteri. Ini disebut siklus litik bakteriofag.

Fag yang dilepaskan menginfeksi kembali sel hidup. Kemampuan mentransfer DNA virus dari sel bakteri spesifik kapsid fag memberi wawasan kepada para ilmuwan untuk mengeksploitasi bakteriofag dan merancangnya sebagai vektor kloning.

Kedua bakteriofag yaitu fag X dan Ml3 telah dimodifikasi dan digunakan sebagai vektor kloning.

(i) Fase X:

Fag X menginfeksi E. coli. Ini memiliki genom DNA beruntai ganda 48,514 kb. Itu ada sebagai molekul linier dengan proyeksi untai tunggal panjang 12 nukleotida komplementer di setiap ujungnya. Oleh karena itu, ini diedarkan setelah dimasukkan ke dalam sel E. coli.

Proyeksi panjang 12 nukleotida menunjukkan keterpaduan dan membentuk situs COS (cohesive site). Genom fag memiliki wilayah non-esensial besar yang tidak terlibat dalam lisis sel.

Memanfaatkan dua jenis vektor kloning dapat diproduksi, baik dengan memasukkan DNA asing (vektor penyisipan) atau menggantinya dengan DNA asing (vektor pengganti). Batas atas DNA asing yang akan dikemas adalah sekitar 23 kb.

Fase M13:

M13 adalah fag berfilamen E. coli yang hanya menginfeksi sel-sel yang mengandung pili seks. M13 terdiri dari molekul DNA sirkular beruntai tunggal yang memiliki 6.407 basa. Itu mendarat di pilus seks dan mengirimkan DNA-nya ke dalam sel melalui lumen pilus.

Setelah pengiriman, DNA diubah dari molekul beruntai tunggal menjadi molekul beruntai ganda. Ini disebut bentuk replikatif (RF) dari DNA. RF M13 bereplikasi dan membentuk 50-100 RF ) molekul per sel.

Akhirnya, molekul DNA beruntai tunggal diproduksi dari DNA RF dan keluar dari sel sebagai partikel M13. Molekul keturunan dikemas pada ekstrusi melalui dinding sel. Sel-sel tidak terbunuh tetapi tumbuh perlahan.

DNA asing sekitar 500 bp dapat dikloning menjadi urutan kloning ganda yang membentuk bagian dari gen lacZ termodifikasi hasil kloning pada RF beruntai ganda Ml3. Strategi yang berbeda diikuti ketika DNA asing berukuran besar akan dikloning.

Untuk pengembangan vektor berbasis M13, RF dapat dimurnikan dan dimanipulasi. DNA asing yang dimasukkan ke dalam vektor M13 dapat diperoleh sebagai DNA beruntai tunggal. Bentuk kloning gen ini sangat berguna untuk pengurutan DNA dan mutagenesis terarah-situs seperti yang dibahas pada bagian sebelumnya.

(ii) Vektor Kosmid:

Untuk pertama kalinya J. Collins dan B. Hohn pertama kali mengembangkan kosmid pada tahun 1978. Kosmid adalah vektor yang dibangun dengan menyatukan beberapa bagian DNA plasmid dengan situs COS dari fag X (situs COS + plasmid = kosmid).

Vektor kosmid memiliki gen ori (asal replikasi), penanda genetik yang dapat dipilih (untuk resistensi antibiotik), situs pengenalan yang cocok untuk enzim restriksi (yaitu situs kloning) dan situs COS kohesif.

Verctor kosmid mengedarkan melalui situs COS dan bereplikasi sebagai plasmid. Batas atas DNA asing yang akan dikemas ke dalam kosmid kosmid untuk kloning adalah sekitar 45 kb.

(iii) Vektor YAC:

Kromosom buatan ragi (YAC) telah dikembangkan sebagai vektor berkapasitas tinggi yang dapat mengkloning segmen DNA yang sangat besar dengan panjang sekitar 1 Mb. Itu dipertahankan sebagai kromosom terpisah di dalam sel.

Ini telah digunakan untuk pemetaan fisik kromosom manusia dalam ‘Proyek Genom Manusia’.

Plasmid pYAC berisi asal replikasi E. coli (ori E ) dan penanda yang dapat dipilih (amp r ), sekuens DNA ragi, masing-masing gen untuk jalur biosintesis urasil (URA3) menyediakan fungsi sentromerik (CEN), sekuens replikasi otomatis (ARS ), urutan jalur sintesis triptofan (TRP) dan telomerik (T). Ada situs pengenalan untuk enzim restriksi seperti Sma dan BamHl.

(iv) Vektor BAC:

Kromosom buatan bakteri (BAC) digunakan sebagai vektor kloning. BAC dibangun dengan menggunakan Fertility atau faktor F (ada pada F plasmid) dari E. coli.

Vektor BAC mengandung gen ori, gen untuk pemeliharaan faktor F, penanda yang dapat dipilih (gen resistensi antibiotik) dan banyak situs restriksi untuk penyisipan DNA asing. Batas atas DNA asing yang akan dimasukkan ke dalam BAC adalah sekitar 300-3500 kb. Ini digunakan dalam proyek pengurutan genom.

(c) Vektor Virus Hewan:

Di alam terdapat beberapa virus yang menyebabkan penyakit. Virus terserap ke permukaan tubuh inang yang cocok dan menginfeksi sel. Kemampuan virus hewan ini telah dieksploitasi dan vektor berbasis virus telah dirancang untuk memperkenalkan DNA asing dengan fungsi yang diketahui ke dalam kultur sel eukariotik.

Pada tahun 1979, untuk pertama kalinya dibangun vektor kloning berbasis simivian virus 40 (SV40) dan digunakan dalam percobaan kloning menggunakan sel mamalia. Sejak itu beberapa vektor dibangun menggunakan adenovirus, papillomavirus, retrovirus untuk mengkloning DNA asing ke dalam sel mamalia, dan Baculovirus dalam sel serangga.

Dalam beberapa tahun terakhir, vektor berbasis retrovirus biasanya digunakan untuk kloning gen. Gen gag, pol dan env retrovirus (yang diperlukan untuk replikasi dan perakitan partikel virus) dapat diganti dengan DNA asing. rDNA dimasukkan ke dalam sel mamalia dalam kultur jaringan.

(d) Menanam Vektor Viral:

Ada beberapa virus tanaman yang menyebabkan kerugian serius pada tanaman budidaya. Beberapa virus [misalnya virus mosaik tembakau (TMV), virus mosaik kembang kol (CaMV), virus potyvirus, gemnivirus, dll.] telah digunakan sebagai vektor tetapi keberhasilan telah dicapai sampai batas tertentu. Beberapa fitur CaMV dikaitkan dengan penggunaannya sebagai vektor.

Salah satu cirinya adalah DNA telanjangnya tidak efektif dan langsung masuk ke sel tanaman jika digosokkan ke daun setelah abrasi ringan. Selain itu, ukuran genom CaMV kecil; karenanya semua genom penting yang tidak dapat dideteksi untuk memasukkan DNA asing. Ini terdiri dari promotor yang sangat kuat tetapi rentang inangnya yang terbatas menjamin kemungkinan penggunaannya sebagai vektor yang efisien.

Pendekatan kedua adalah transfer gen patogen-derived resistance (PDR) ke dalam tanaman inang. Untuk PDR, bagian dari gen virus lengkap dimasukkan ke dalam inang yang mengganggu satu atau lebih langkah penting dalam siklus hidup virus.

Untuk pertama kalinya Roger Beachy memperkenalkan protein mantel (CP) TMV ke dalam tembakau dan mengamati resistensi TMV pada tanaman tembakau transgenik.

  1. Sel Inang :

Untuk perbanyakan DNA asing sel inang yang efisien diperlukan. Berbagai jenis sel inang seperti E. coli, ragi, sel tumbuhan dan hewan tersedia untuk kloning gen. Sel-sel ini digunakan sesuai dengan tujuan percobaan.

Terlepas dari banyak jenis sel dari berbagai kelompok organisme, E. coli paling berhasil digunakan karena (i) mudah ditangani, (ii) menggandakan jumlah selnya setiap 20 menit, (iii) rDNA juga bereproduksi seiring dengan penggandaan bakteri, (iv) dalam beberapa jam ribuan sel bakteri dan sejumlah besar gen asing diproduksi dan protein rekombinan diekspresikan. Protein diisolasi dan dimurnikan dari sel.

Selain itu, untuk ekspresi gen eukariotik, inang eukariotik seperti sel ragi dieksploitasi. Seperti E. coli, khamir juga memiliki beberapa keunggulan seperti (i) mudah tumbuh dan dimanipulasi, (ii) eukariota uniseluler yang paling sederhana, (iii) berkarakteristik baik, (iv) tidak membutuhkan media yang kompleks, dll., dan (v) perbanyakannya di laboratorium dalam bejana kecil atau fermentor berukuran besar.

Gen asing eukariotik membutuhkan sel eukariotik untuk ekspresinya karena (i) sel inang eukariotik mengandung enzim penyambung untuk menghilangkan intron tetapi bukan sel prokariotik, (ii) sistem enzim inang eukariotik memfasilitasi pelipatan protein yang tepat ke dalam struktur 3D dan modifikasinya (penambahan gugus metil ke protein, dll.).

Sel tumbuhan dan hewan yang dikultur atau seluruh tubuhnya digunakan untuk pengenalan gen asing. Mengikuti strategi ini banyak tanaman dan hewan telah dimodifikasi secara genetik dan tanaman dan hewan transgenik telah diproduksi.

  1. Konstruksi Molekul DNA Rekombinan :

Strategi pembuatan DNA rekombinan sebelumnya telah dibahas pada Bagian 1. Langkah pertamanya adalah mengisolasi atau mendapatkan DNA asing dengan fungsi yang diinginkan dan vektor kloning yang efisien. DNA yang akan dikloning dan vektor kloning mengandung situs pengenalan untuk pembelahan oleh endonuklease restriksi.

Kedua jenis molekul DNA ini dicerna secara terpisah dengan enzim restriksi yang sama sehingga menghasilkan ujung yang lengket. Ujung lengket DNA asing dan vektor plasmid dicampur dan diinkubasi dengan adanya DNA ligase. Akibatnya, ikatan hidrogen terbentuk antara nukleotida komplementer.

DNA ligase membentuk ikatan fosfodiester antara dua ujung lengket DNA target dan DNA vektor. Ini menghasilkan pembentukan DNA rekombinan yang bergabung secara kovalen (rDNA). Ada kemungkinan lain untuk menggabungkan ujung lengket dan menjadi vektor plasmid sirkuler tanpa penyisipan DNA target. Ini disebut DNA non-rekombinan.

Jika vektor yang dicerna diperlakukan dengan alkali fosfatase atau enzim restriksi lainnya, gugus fosfat dihilangkan. Oleh karena itu, masih ada sedikit kemungkinan untuk self-ligation dari vektor kloning.

Related Posts