Apa itu Mutagenesis Terarah-Situs?

Di alam, mutasi muncul secara spontan tetapi jarang terjadi seperti anemia sel sabit. Banyak yang telah dijelaskan tentang mutasi dalam A Textbook of Biotechnology for Class XI. Metode yang paling ampuh untuk memasukkan mutasi titik ke dalam gen dikenal sebagai mutagenesis terarah ‘oligonukleotida (situs).

Perubahan pasangan basa nukleotida tunggal disebut ‘mutasi titik’. Beberapa sifat yang berguna dalam protein (seperti stabilitas dalam subtilisin) dapat diberikan melalui mutasi titik yang menghasilkan substitusi asam amino terpilih.

Dengan menggunakan teknik ini, titik spesifik suatu gen dapat dimutasi. Oleh karena itu, metode ini telah digunakan untuk memahami fungsi banyak gen. Selain itu, teknik ini hanya dapat digunakan jika urutan nukleotida gen diketahui.

Ketika telah diputuskan basa mana yang akan diubah (misalnya A), oligonukleotida disintesis secara kimiawi (A). Urutan oligonukleotida memiliki mutasi yang diinginkan di situs tertentu. Oligonukleotida sesuai dengan nukleotida yang bermutasi dan daerah tetangganya, terutama dengan panjang antara 15 dan 20 nukleotida. Klon untaian tunggal dari gen tipe liar diproduksi dengan menggunakan vektor berbasis fag M13.

Oligonukleotida dibiarkan berhibridisasi dengan klon beruntai tunggal. Hibridisasi dilakukan pada kondisi keketatan rendah yaitu suhu rendah dan konsentrasi garam tinggi.

Oligonukleotida akan berpasangan dengan urutan komplementer tipe liar (B) dan bertindak sebagai primer untuk menghasilkan DNA beruntai ganda dengan menggunakan DNA polimerase (C). DNA beruntai ganda terdiri dari satu urutan tipe liar dan urutan mutan lainnya (C). Sel-sel bakteri diubah dengan memperkenalkan molekul beruntai ganda di dalamnya. DNA dupleks bereplikasi dalam sel bakteri dan menghasilkan tipe liar atau plasmid mutan.

Replikasi DNA dalam sel bakteri akan menghasilkan campuran DNA untai ganda (D) tipe liar dan mutan. Ini dapat diekstraksi dan digunakan untuk mengubah lebih banyak sel. Sejauh ini belum bisa dipastikan apakah ada mutasi pada DNA yang diinginkan atau tidak. Untuk memastikannya, DNA diisolasi dari sel bakteri dan diurutkan mengikuti metode sekuensing seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Mengikuti mutagenesis yang diarahkan ke lokasi, beberapa protein dan enzim baru telah diproduksi dan dikomersialkan seperti subtilisin, p-laktamase, sintetase tirosin-tRNA, dll.

Related Posts