Apa itu Perpustakaan DNA?

Pustaka gen adalah kumpulan urutan DNA yang berbeda dari suatu organisme di mana setiap urutan telah dikloning menjadi vektor untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan, dan analisis.

Ada dua jenis perpustakaan berdasarkan sumber DNA yang digunakan (i) perpustakaan genom (di mana DNA genom digunakan), dan (ii) perpustakaan cDNA (di mana cDNA atau DNA komplementer diproduksi menggunakan mRNA).

Pustaka gen harus berisi sejumlah rekombinan dengan probabilitas tinggi untuk memuat sekuens tertentu. Nilai ini dapat dihitung jika Anda mengetahui ukuran genom dan ukuran rata-rata yang disisipkan dalam vektor.

Probabilitas mendapatkan sekuens tertentu dalam pustaka gen, jumlah (N) rekombinan (koloni bakteri atau plak virus) dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

  1. Perpustakaan Genom :

Ini adalah kumpulan klon yang mewakili genom lengkap suatu organisme. Semua fragmen DNA yang dimasukkan ke dalam vektor untuk perbanyakan lebih lanjut ke inang yang sesuai mewakili seluruh genom suatu organisme.

Untuk pembangunan perpustakaan genom, seluruh DNA genom diisolasi dari sel/jaringan inang, dimurnikan dan dipecah secara acak menjadi fragmen dengan ukuran yang benar untuk dikloning menjadi vektor yang sesuai.

Ada dua cara dasar untuk memecah-mecah DNA genomik secara acak: pemotongan fisik (misalnya pemipetan, pencampuran atau sonikasi) dan pencernaan enzim restriksi parsial (dengan menggunakan jumlah terbatas enzim restriksi, DNA tidak dicerna pada setiap urutan pengenalan). Dengan menggunakan metode ini DNA genom dipecah secara acak menjadi fragmen yang lebih kecil.

Ini menunjukkan total 6 fragmen DNA acak yang diperoleh setelah pemotongan fisik. Vektor yang diisolasi dari bakteri juga dicerna dengan enzim restriksi yang sama yang mencerna DNA genomik.

Fragmen DNA genom dimasukkan ke dalam vektor. Setiap vektor terdiri dari fragmen DNA yang berbeda. Molekul DNA rekombinan ditransfer ke sel bakteri atau partikel bakteriofag dirakit.

Perpustakaan genom untuk organisme dengan ukuran genom yang lebih kecil (misalnya E. coli) dapat dibangun dalam vektor plasmid. Hanya 5.000 klon (dari ukuran rata-rata 5.000 bp) menghasilkan 99% peluang untuk mengkloning seluruh genom berukuran 4,6×10 6 bp. Selain itu, perpustakaan dari organisme dengan genom yang lebih besar dibangun menggunakan vektor fag X, kosmid, BAC atau YAC.

  1. Perpustakaan cDNA

Reverse transcriptase untai tunggal cDNA disintesis pada template mRNA dengan menggunakan primer oligo (dT) (Gbr. 3.12). Hidrolisis alkali oleh NaOH memisahkan cDNA beruntai tunggal dari mRNA.

Oligo (dG) digunakan untuk sintesis utama untai kedua dengan menggunakan reverse transcriptase atau fragmen Klenow E. coli DNA polimerase I. Hal ini menghasilkan pembentukan kompleks cDNA.

Penaut asam nukleat khusus dan enzim restriksi ditambahkan untuk membuat ujung lengket di dupleks cDNA untuk kloning dalam vektor. Molekul DNA rekombinan dimasukkan ke dalam sel inang.

Related Posts