Dapatkan Informasi Lengkap Asam Amino N-Terminal Suatu Protein

Asam Amino N-Terminal dari Protein

  1. Objektif :

Identifikasi asam amino N-terminal suatu protein menggunakan metode dansil klorida.

  1. Prinsip :

Kristal asam amino berwarna putih dan larutannya tampak tidak berwarna. Identifikasi asam amino tergantung pada jumlah karbon, oksigen, nitrogen, belerang, kelarutannya, titik leleh, sifat koligatif, dll. Secara khusus, dansil klorida bereaksi dengan gugus amino bebas dari residu asam amino N-terminal suatu protein.

Setelah hidrolisis asam itu menghasilkan pembentukan asam amino dansylated dan asam amino bebas lainnya dipisahkan. Mereka dapat diidentifikasi menggunakan sinar ultra violet. Di bawah sinar UV asam amino dansyl tampak berwarna kuning kehijauan.

  1. Persyaratan :

I. Larutan Dansyl chloride (2,5 mg/ml dalam aseton) (siapkan segar) dan simpan pada suhu 4°C dalam lemari es.

  1. 0,2 M larutan encer natrium bikarbonat (simpan pada suhu 4°C, saat tidak digunakan).

iii. Tabung pengapian/tabung reaksi disebut sebagai ‘tabung dansyl’ (5 cm x 2 mm).

  1. Pelat Dansyl [pelat lapis tipis poliamida (kedua sisi dilapisi 5 cm x 5 cm)] dilapisi kedua sisinya. Beri nomor piring dengan pensil di sudut atas.
  2. Tandai titik awal pemuatan dengan pensil 0,3-0,5 cm dari setiap tepi di sudut kiri bawah sisi pelat yang diberi nomor (titik awal pemuatan di sisi belakang pelat harus tepat di belakang posisi pemuatan untuk bagian depan pelat yaitu 0,3-0,5 mm dari setiap tepi di sudut kanan bawah).
  3. Siapkan dua pelarut kromatografi sebagai berikut: Pelarut 1: Asam format : air (4,5: 100, v/v) Pelarut 2: Toluena : asam asetat (8:1, v/v)
  4. Sumber ultra violet (254 |im atau 265 |im), pompa vakum, desikator.
  5. Prosedur:
  6. Untuk Asam Amino :

(i) Siapkan larutan stok (lmg/ml) asam amino dansil standar dalam 0,2 M NaHC0 3 . (asam amino dansyl standar adalah – Pro, Leu, Phe, Thr, Glu, Arg. Simpan larutan stok pada suhu 4°C saat tidak digunakan).

(ii) Pindahkan 10 µl masing-masing larutan asam amino ke dalam tabung dansil dan aduk perlahan. Tambahkan 30 |il larutan dansil klorida (5 µl untuk setiap asam amino).

(iii) Tambahkan 10 µl asam amino yang tidak diketahui dan 5 µl dansyl chlqride dalam tabung dansyl yang terpisah.

(iv) Tutup tabung dengan parafilm dan inkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam pada suhu kamar selama 3 jam).

(v) Keringkan sampel dalam ruang hampa karena volume cairan yang kecil akan memakan waktu sekitar 5 menit.

(vi) Larutkan sampel kering dalam 10 µl aseton menggunakan tabung kapiler. Muatkan 1 |iil alikuot dari campuran standar pada asalnya (diameter noda tidak boleh melebihi 1-2 mm).

(vii) Masukkan 1 µl asam amino yang tidak diketahui pada sisi sebaliknya.

(viii) Tempatkan pelat dalam pelarut kromatografi pertama saat sampel yang dimuat benar-benar kering. Biarkan pelat mengembang dan pelarut mencapai bagian atas. Keringkan kedua sisi piring.

(ix) Kembangkan pelat dansil dalam pelarut kedua dengan sudut siku-siku ke arah pengembangan dalam pelarut pertama. Keringkan pelat sampai bagian depan pelarut mencapai bagian atas.

(x) Amati pelat di bawah sinar UV.

  1. Untuk Protein

(.i) Transfer 10 µg protein dalam 10 µl 0,2 M NaHC0 3 dalam 1 ml tabung bersumbat.

(ii) Tuang 10 µl larutan dansil klorida ke dalamnya.

(iii) Tutup tabung dan inkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam (atau pada suhu kamar selama 3 jam).

(iv) Keringkan sampel dalam ruang hampa.

(v) Pindahkan 20 µl HC1 6 N ke tabung 1 ml dan tutup tabung rapat-rapat dengan sumbat. Hidrolisis disimpan dalam oven dengan suhu 105±1 0 C selama 24 jam.

(vi) Keringkan sampel dalam ruang hampa.

(vii) Larutkan sampel kering dalam 10 µl aseton dan masukkan 1 µl alikuot campuran standar pada titik awal menggunakan tabung kapiler halus. Diameter titik tidak boleh melebihi 1-2 mm.

(viii) Masukkan 1 µl protein hidrolisat yang mengandung asam amino dansil yang tidak diketahui pada sisi sebaliknya.

(ix) Tempatkan pelat dalam pelarut kromatografi pertama saat sampel yang dimasukkan benar-benar kering. Biarkan pelat berkembang dan mencapai pelarut ke atas. Keringkan kedua sisi piring.

(x) Kembangkan pelat dansyl dalam pelarut kedua pada sudut kanan ke arah pengembangan seperti yang ditemukan dalam pelarut pertama. Tunggu untuk mencapai pelarut ke atas, dan keringkan piring.

(xi) Amati tanaman di bawah sinar UV.

  1. Hasil :

Anda harus mengidentifikasi tiga area neon utama di bagian bawah pelat. Dansil klorida dihidrolisis menjadi dansil hidroksida. Produk yang dihidrolisis muncul sebagai area fluoresen biru. Dansyl amide (diproduksi oleh reaksi samping dengan Nis 3 ) menunjukkan fluoresensi biru-hijau dan sekitar sepertiga dari jalan di atas pelat.

Kedua titik ini adalah penanda internal yang berguna yang muncul di semua pelat dansyle. Bintik ketiga berpendar hijau dan akan sesuai dengan turunan dansil dari asam amino. Pelarut 2 memisahkan turunan dansil dari asam amino hidrofobik dan beberapa asam amino alami.

Turunan dari asam amino bermuatan dan asam amino netral lainnya tetap berada di ujung bawah kromatogram. Kromatogram dibandingkan dengan standar yang disediakan di laboratorium Anda.

Related Posts