Dapatkan Informasi Lengkap Kromatografi Pertukaran Ion

Kromatografi Pertukaran Ion

  1. Objektif :

Isolasi enzim lisozim dari putih telur ayam menggunakan kromatografi penukar kation.

Pada tahun 1903 ahli botani Rusia Mikhail Tswett mengembangkan kromatografi untuk memisahkan campuran pigmen tumbuhan menggunakan kolom kalsium karbonat. Ia menjadi ilmuwan pertama yang mengakui bahwa klorofil bukanlah senyawa kimia tunggal.

Oleh karena itu, teknik kromatografi yang mengeksploitasi berbagai sifat fisik dan kimia biomolekul telah dikembangkan misalnya kromatografi penukar ion, kromatografi saringan molekuler, dll. Untuk detail lihat teks.

Cara distribusi senyawa antara dua fase yang tidak bercampur dijelaskan oleh partisi atau koefisien distribusi K d . Nilai ini berbeda untuk biomolekul yang berbeda. Fitur-fitur ini digunakan untuk pemisahan biomolekul dari satu sama lain.

Perlu dicatat bahwa fase diam terdapat dalam semua sistem kromatografi yang dapat berupa padatan, gel, cairan atau campuran padat/cair yang tidak bergerak. Fase gerak dapat berupa fase cair atau gas.

Atas dasar muatan bersihnya, kromatografi penukar ion digunakan untuk memisahkan molekul bermuatan. Pada dasarnya, ada dua jenis penukar ion: penukar kation (yang menukar kation yaitu protein bermuatan positif) dan penukar anion (yang menukar anion pada protein bermuatan negatif).

Jika protein memiliki muatan positif bersih pada pW 7.0, ia akan berikatan dengan penukar kation, tetapi tidak pada protein bermuatan negatif. Demikian pula, jika protein memiliki muatan negatif bersih pada pH 7,0, ia akan bergabung menjadi penukar anion, sedangkan protein bermuatan positif tidak akan mengikatnya. Protein yang terikat dapat dielusi dengan meningkatkan konsentrasi garam atau mengubah pH penyangga elusi.

  1. Prinsip :

Pada pH 7,0 lisozim bekerja pada kation yaitu ion bermuatan positif. Oleh karena itu, ia berikatan dengan penukar kation yaitu karboksi metilselulosa (CMC). Ini membantu untuk dipisahkan dari protein bermuatan negatif lainnya. Anda dapat mengelusi lisozim dengan menggantinya dengan kation yang lebih kuat (Na + dalam NaCl).

  1. Persyaratan :

I. Karboksi metil selulosa (CMC) (kolom penukar kation) (5 ml gel)

  1. Dudukan kolom, kolom kosong

iii. Bakteri, Micrococcus luteus

  1. Standar lisozim, telur ayam, spektrofotometer, centrifuge

v.1M NaCl

  1. Agen penetral (0,1 N HC1)
  2. Siapkan buffer segar seperti di bawah ini:

Penyangga kesetimbangan: 0,067 M penyangga fosfat, /;H 7,0

Buffer pencuci: buffer fosfat 0,067 M, pH 7,0

Penyangga elusi: penyangga fosfat 0,067 M yang mengandung 0,5 M NaCl

  1. Prosedur :

(i) Siapkan dudukan, pasang kolom di atasnya dan kemas dengan 2,5 ml CMC.

(ii) Tambahkan 25 ml buffer kesetimbangan untuk menyeimbangkan kolom.

(iii) Kumpulkan 5 ml putih telur setelah memecahkan telur. Tambahkan air suling dengan volume yang sama dan aduk rata.

(iv) Dengan bantuan pengukur pH atau strip kertas pH, tambahkan larutan penetral secara perlahan (hal ini menyebabkan sedikit kekeruhan pada putih telur).

(v) Sentrifuge putih telur pada 7.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C dan kumpulkan supernatan.

(vi) Tambahkan supernatan yang tersisa ke kolom CMC yang diseimbangkan.

(vii) Dengan pencampuran intermiten, inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar.

(viii) Setelah 30 menit, biarkan CMC diselesaikan. Tanpa mengganggu gel perlahan tuang sisa supernatan.

(ix) Menggunakan buffer pencuci 30 ml mencuci kolom.

(x) Menggunakan 7,5 ml buffer elusi mengelusi lisozim dari kolom.

(xi) Sebelum disimpan untuk penggunaan selanjutnya, cuci kolom dengan 10 ml larutan NaCl 1 M (kolom dapat digunakan kembali 2-3 kali).

(xii) Hitung konsentrasi protein dalam beban.

(xiii) Elusi dengan menggunakan metode pendugaan protein biuret (lihat Bab 11; Eksperimen XV).

(xiv) Ukur aktivitas lisozim dalam muatan dan eluasi.

Prinsip Pengukuran Aktivitas Lisozim: Lisozim melisiskan dinding sel bakteri dan menghidrolisis lapisan peptidoglikan dinding. Misalnya, ketika suspensi M. luteus (bakteri Gram-positif) direaksikan dengan lisozim, suspensi keruh menjadi jelas karena lisis dinding sel.

Lisis sel dapat diukur dengan memperkirakan absorbansi suspensi pada 450 nm sebelum dan sesudah lisis sel. Awalnya suspensi sel bakteri menghamburkan lebih banyak cahaya, sehingga absorbansinya lebih tinggi.

Sel-sel yang lisis menyebarkan lebih sedikit cahaya, sehingga absorbansi menurun. Aktivitas lisozim dibandingkan dengan larutan standar lisozim yang mengandung jumlah protein yang diketahui. Itu dilakukan seperti di bawah ini:

(i) Siapkan larutan standar lisozim dengan melarutkan 1 mg lisozim dalam 3 ml buffer fosfat 0,07 M (larutan terdiri dari 0,3 mg lisozim/ml).

(ii) Encerkan suspensi M. luteus dengan menambahkan dapar fosfat (pH 7,0; 0,07 M) sehingga diperoleh A 450 antara 0,5 dan 0,7).

(iii) Tuangkan 3 ml suspensi M. luteus yang telah diencerkan ke dalam kuvet dan ukur OD pada 450 nm. Ini memberikan nilai OD pada 0 detik. Ke dalam kuvet ini tambahkan 50 (il lisozim standar dan catat waktu. Campur perlahan isi kuvet selama 15 detik. Kemudian simpan kuvet dalam spektrofotometer dan ukur OD pada 450 nm setelah 60 detik penambahan lisozim. Ulangi proses yang sama untuk elusi dan muat selama 2-3 kali.

Related Posts