Dapatkan Informasi Lengkap Penyusunan Sel Kompeten E.coli

Persiapan Sel Kompeten E.coli

  1. Tujuan:

Persiapan sel-sel kompeten E.coli dan transformasi sel-sel ini dengan plasmid tertentu.

  1. Pendahuluan:

Selama tahun 1970, ditemukan bahwa sel E.coli yang direndam dalam larutan es dingin lebih efisien dalam menerima DNA asing daripada sel normal yang diberi perlakuan. Oleh karena itu, sel E.coli dapat dibuat lebih kompeten di laboratorium dengan mengolah larutan dingin atau CaCl 2 , rubidium klorida atau garam lainnya.

Proses penerimaan DNA asing disebut transformasi yang didemonstrasikan pertama kali pada tahun 1928 oleh Griffith. Dalam kondisi normal beberapa bakteri seperti E. coli menerima DNA dalam jumlah terbatas.

Oleh karena itu, untuk memasukkan DNA asing secara efisien ke dalam sel-sel ini, sel tersebut harus menjalani perawatan kimia. Akibatnya, efisiensi penerimaan DNA asing meningkat. Sel yang diperlakukan secara kimia seperti itu disebut sel kompeten.

  1. Prinsip:

Dengan penambahan larutan CaCl 2 , ion Ca 2+ mengacaukan membran sel atau juga membentuk kompleks dengan DNA asing yang menempel pada permukaan sel. Dengan menaikkan suhu secara perlahan ke 42°C, pengambilan DNA asing oleh sel E. coli distimulasi.

Sel E. coli yang telah ditransformasi dapat ditempatkan pada pelat LB yang berisi antibiotik yang sesuai (bergantung pada gen resistensi antibiotik yang ada pada DNA plasmid yang digunakan untuk transformasi). Kemudian sel-sel yang tumbuh pada media tersebut dipilih dan dimurnikan.

  1. Persyaratan :

I. Strain inang E. coli, DNA Plasmid, natrium klorida, ekstrak ragi

  1. Agar, natrium hidroksida, kalsium klorida

iii. Antibiotik yang cocok (misalnya streptomisin), tryptone, tabung eppendorf

  1. Tip, mikropipet, tabung centrifuge.

Persiapan Lab:

Persiapan berikut harus dilakukan sebelumnya:

Hari pertama:

Guratkan suspensi E. coli pada permukaan pelat LB segar sehingga satu koloni dapat diperoleh. Inkubasi cawan pada suhu 37°C semalaman.

Hari kedua:

Di malam hari pilih satu koloni dan pindahkan ke dalam 5 ml kaldu LB. Inkubasi tabung pada suhu 37°C pada shaker (200-250 rpm) selama sekitar 16 sampai 18 jam.

Pada hari ketiga:

Kembangkan sel E. coli yang kompeten seperti yang dijelaskan di bawah ini:

  1. Prosedur :
  2. Pengembangan Kompeten Sel E. Coli:

(i) Tuang 1 ml biakan murni yang diperoleh pada hari ke-3 seperti yang diberikan pada langkah (ii) ke dalam 100 ml media LB dan inkubasi pada suhu 37°C pada shaker (200-250 rpm). Tumbuhkan biakan untuk mendapatkan OD 0,3-0,5 pada 600 nm (A 600 ) (diperlukan 2-3 jam).

(ii) Kemudian dengan cepat simpan labu kultur di atas es di lemari es selama 10-20 menit.

(iii) Pindahkan kultur ke dalam tabung centrifuge steril dalam aliran udara laminar.

(iv) Sentrifugasi pada 6.000 rpm selama 8 menit pada suhu 4°C (lebih disukai sentrifugal berpendingin).

(y) Buang supernatan dalam aliran udara laminar. Tambahkan 6 ml kalsium klorida 0,1 M dingin

(CaCl 2 ) ke pelet sel. Menyimpan tabung di ember es, suspensikan pelet sel dengan hati-hati dalam CaCl 2 . Simpan tabung centrifuge di atas es selama 30 menit.

(vi) Sentrifuse sel pada 6.000 rpm selama 8 menit pada suhu 4°C, jika memungkinkan.

(vii) Dalam aliran udara laminar buang supernatan dan suspensikan kembali pelet sel dengan hati-hati dalam 0,5 ml 0,1M CaCl2 sedingin es . Sel-sel menjadi kompeten.

(viii) Pindahkan 100 pi sel kompeten di atas ke dalam tabung eppendorf 5 (perhatian harus dilakukan untuk semua pekerjaan pemindahan yang dilakukan di atas es dan di aliran udara laminar).

  1. Transformasi Kompeten Sel E. Coli:

(Semua langkah harus dilakukan di dalam laminar airflow)

(i) Tambahkan 5 µl DNA plasmid (sekitar 10-50 nanogram) ke dalam 100 pi sel kompeten yang telah disiapkan. Ketuk perlahan dan simpan tabung eppendorf di atas es selama 20 menit.

(ii) Pertahankan suhu water-bath pada 42°C. Simpan tabung eppendorf di bak air sedemikian rupa sehingga sel yang kompeten harus terendam selama 2 menit. Selama inkubasi dalam air-bath suhu harus dipertahankan secara akurat.

(iii) Setelah heat shock segera lepas tabung eppendorf dan letakkan di atas es selama 2 menit.

(iv) Tuang 1 ml media LB ke dalam tabung eppendorf dan inkubasi kultur selama 1 jam pada suhu 37°C. Ini membantu bakteri pulih dari sengatan panas dan menunjukkan resistensi antibiotik.

(v) Siapkan pelat LB yang mengandung streptomisin atau ampisilin atau antibiotik lain yang sesuai tergantung pada plasmid yang digunakan (cairkan media LB-agar yang telah diautoklaf dan biarkan hingga dingin. Saat suhu agar sekitar 44°C, tambahkan konsentrasi antibiotik yang diperlukan ke dalamnya, misalnya 100 µg/ml ampisilin, aduk rata dan tuang ke cawan Petri.

(vi) Tambahkan 50 µl, 100 (il dan 200 µl sel E. coli hasil transformasi secara terpisah [diperoleh setelah langkah (iv)] ke tiga lempeng yang berbeda. Sebarkan sel dengan baik menggunakan penyebar. Sebagai kontrol, sel kompeten yang belum telah ditransformasi dengan DNA plasmid juga harus disepuh ke piring untuk menyingkirkan kontaminasi sel. Demikian pula, transfer sel E. coli kompeten yang tidak ditransformasi pada media LB yang mengandung antibiotik sebagai kontrol untuk menyingkirkan kontaminasi.

(vii) Inkubasi cawan pada suhu 37°C semalaman dan amati keesokan harinya.

  1. Hasil :

Pelat kontrol tidak menunjukkan koloni di mana sel kompeten yang tidak mengandung DNA plasmid tersebar. Pelat lain menunjukkan koloni tempat sel kompeten yang ditransformasikan dengan plasmid tersebar.

Related Posts