Dapatkan Informasi Lengkap Sequencing DNA

Dapatkan Informasi Lengkap Sequencing DNA

  1. Objektif :

Untuk melakukan sekuensing DNA dan menentukan sekuen DNA dengan membaca autoradiogram yang diperoleh dari gel sekuensing.

  1. pengantar :

Ada beberapa metode untuk sequencing DNA tetapi yang paling populer adalah metode dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP) atau metode terminasi rantai yang diusulkan oleh kelompok F. Sanger pada tahun 1977. Langkah dasar diikuti dalam metode ini untuk mendapatkan autoradiogram.

Langkah I:

Dua untai komplementer dipisahkan menghasilkan dua untai tunggal dengan mendenaturasi fragmen DNA untuk diurutkan dengan alkali. Masing-masing dari dua helai diurutkan secara terpisah.

Langkah II:

Campuran reaksi pengurutan mencakup untai tunggal DNA (yang akan diurutkan) primer berlabel radio yang sesuai, NTP dan DNA polimerase. Campuran ini didistribusikan ke dalam 4 tabung, diberi label A, T, G dan C. Sejumlah kecil ddATP, ddTTP, ddGTP dan ddCTP ditambahkan masing-masing dalam tabung A, T, G, C.

Langkah III:

Kemudian, campuran reaksi dari masing-masing tabung dijalankan pada gel poliakrilamida dalam empat jalur terpisah berlabel A, T, G dan C. Di setiap jalur, untaian DNA dipisahkan (menurut ukurannya) dimana fragmen DNA berbeda bahkan dalam satu panjang nukleotida dapat diselesaikan.

Langkah IV:

Dengan menyelaraskan gel secara erat dengan film sinar-X diikuti dengan mengembangkan film dalam pengembang yang sesuai, sebuah autoradiogram disiapkan. Pita DNA muncul sebagai pita gelap pada autoradiogram.

Langkah V:

Pembacaan autoradiogram.

  1. Prinsip :

DNA polimerase membuat salinan untai tunggal DNA yang akan diurutkan yang memperluas primer yang dianil ke ujung 3′ untai DNA.

Perpanjangan berakhir dan fragmen yang lebih pendek dihasilkan ketika kadang-kadang turunan dideoksi ditambahkan di masing-masing dari empat tabung. Misalnya, dalam tabung di mana ddCTP hadir, fragmen dengan panjang berbeda yang diakhiri dengan residu C diperoleh yang sesuai dengan berbagai posisi G dalam untai DNA yang sedang diurutkan (C komplementer dengan G).

Dengan cara yang sama dalam tabung berlabel ddNTP, fragmen dengan berbagai panjang diperoleh yang sesuai dengan posisi basa komplementer dalam untai DNA yang sedang diurutkan. Menggunakan primer radioaktif, posisi fragmen dapat dilihat menggunakan film autoradiogram (sinar-X).

  1. Prosedur

(i) Pengadaan autoradiogram; pitanya dibaca sebagai A, T, G atau C tergantung pada jalur yang muncul dan dalam urutan peningkatan jaraknya dari ujung bawah (anodik).

(ii) Sintesis untai komplementer baru terjadi dalam arah 5′-8′ yang diakhiri pada berbagai titik karena penggabungan ddNTP.

  1. Hasil :

Urutan untai DNA asli adalah -5’TAATGATCGC3′ -. Untuk detail pergi melalui teks.

Related Posts