Dapatkan informasi lengkap Teknik Kultur

Meskipun sejumlah teknik telah dikembangkan untuk membiakkan sel tanaman tunggal yang terisolasi, berikut ini adalah teknik yang sering digunakan.

(a) Teknik Pelapisan Sel Bergmann:

Ini adalah teknik kultur sel tunggal yang paling populer. Kepadatan sel tunggal yang diisolasi dalam kultur suspensi diseimbangkan menjadi dua kali kepadatan sel pelapisan yang diinginkan. Agar cair (0,6-1%) yang mengandung media dengan komposisi yang sama dengan media kultur suspensi didinginkan dan dipertahankan pada suhu 35°C dalam penangas air.

Volume yang sama dari kedua media dicampur dan dengan cepat disebarkan dalam cawan petri sedemikian rupa sehingga sel-sel didistribusikan secara merata dan difiksasi dalam lapisan tipis media setelah didinginkan dan dipadatkan.

Cawan petri ditutup dengan parafin. Kultur suspensi yang membawa agregat sel selain sel tunggal yang diisolasi harus disaring melalui saluran yang hanya memungkinkan sel tunggal atau agregat sel kecil untuk melewatinya. Agregat sel besar dibuang dan hanya suspensi halus yang dilapisi.

Cawan petri diamati di bawah mikroskop dalam posisi terbalik dan sel tunggal ditandai di bagian luar cawan dengan penanda halus untuk memastikan isolasi klon sel tunggal murni. Kultur yang berisi cawan petri diinkubasi dalam gelap pada suhu 25°C.

Budaya Penangguhan:

Ketika potongan-potongan kalus dipindahkan ke media cair dan media terus diaduk untuk mendapatkan sel tunggal yang diisolasi, kultur disebut ‘kultur suspensi’. Pada dasarnya ada dua jenis kultur suspensi, yaitu kultur batch dan kultur kontinyu.

(i) Kultur batch Bila kultur terus diperbanyak dengan secara rutin mengambil sebagian kecil suspensi dan memindahkannya ke media baru, kultur suspensi disebut ‘kultur batch’.

(ii) Kultur kontinyu Ketika kultur ditumbuhkan dalam bejana kultur dalam kondisi stabil untuk waktu yang lama dengan menambahkan media segar dan mengeringkan media yang digunakan, kultur suspensi disebut ‘kultur kontinu’.

(b) Teknik Filter Paper Raft-Nurse:

Teknik ini telah dikembangkan oleh Muir et al (1954). Ini melibatkan pembiakan sel tunggal yang terisolasi di atas kalus yang tumbuh aktif dipisahkan oleh selembar kertas saring. Yang dilakukan sebenarnya adalah sel tunggal diisolasi dari kultur suspensi dengan bantuan mikropipet.

Beberapa hari sebelum isolasi ini, kertas saring kotak steril berukuran 8 mm x 8 mm ditempatkan dalam kondisi aseptik di atas kalus yang terbentuk, yang disebut “jaringan perawat”, dari spesies yang sama atau berbeda.

Kertas saring dibasahi oleh cairan dan nutrisi dari jaringan perawat. Sel tunggal yang terisolasi sekarang ditempatkan di atas rakit kertas filter basah. Ketika koloni mikroskopis berproliferasi dari sel, ia dipindahkan ke media agar yang cocok untuk pertumbuhan dan perkembangan sel lebih lanjut.

(c) Teknik Microchamber:

Teknik ini telah dikembangkan oleh Jones et al pada tahun 1960. Setetes media nutrisi yang membawa satu sel dikeluarkan dengan mikropipet dari kultur suspensi, dipindahkan pada slide mikroskopis steril. Setetes minyak mineral steril ditempatkan di kedua sisi media-tetes dan kaca penutup ditempatkan pada setiap tetes minyak mineral.

Kaca penutup ketiga sekarang diambil dan ditempatkan pada tetesan media yang menjembatani dua kaca penutup dan membentuk ruang mikro untuk mengurung sel tunggal secara aseptis di dalam minyak mineral. Yang terakhir tidak memungkinkan hilangnya air dari microchamber tetapi memungkinkan pertukaran gas. Seluruh slide kemudian ditempatkan dalam cawan petri dan diinkubasi. Ketika koloni mikroskopis berkembang dari sel, kaca penutup dilepas dan koloni dipindahkan ke media segar yang sesuai untuk pertumbuhan dan perkembangan sel lebih lanjut.

Related Posts