Informasi Lengkap Pemurnian Protein

Ada beberapa ribu protein yang disintesis oleh mikroorganisme, tumbuhan dan hewan. Namun, banyak dari mereka yang dibutuhkan oleh kita dalam kehidupan kita sehari-hari seperti susu, telur, dll.

Beberapa di antaranya adalah protein penyelamat hidup seperti insulin, hemoglobin, imunoglobulin, dll. Dalam beberapa tahun terakhir, protein semacam itu disintesis secara kimia atau dipisahkan dan dimurnikan dari sel atau jaringan tumbuhan dan hewan, dan atau diproduksi secara komersial di fomenter dan melewati pengolahan hilir (yaitu dipisahkan mengikuti berbagai teknik fisika-kimia).

Mikroorganisme yang digunakan untuk produksi protein dalam skala besar disebut sebagai umumnya dianggap aman (GRAS). Mikroorganisme yang termasuk dalam GRAS harus: (j) non-patogen, (ii) tidak beracun, dan (iii) bukan penghasil metabolit sekunder seperti racun dan antibiotik.

Namun, ada beberapa faktor yang mengatur skema pemurnian protein seperti (i) bahan sumber dan lokasi protein di dalamnya yaitu intraseluler atau ekstraseluler, (ii) sifat fisik dan kimia protein, dan (iii) jumlah bahan baku yang dibutuhkan. untuk menghasilkan jumlah protein yang diinginkan. Langkah-langkah pemurnian protein diberikan.

Bahan awal yang digunakan untuk pemurnian protein mewakili jenis dan tingkat kontaminasi. Bahan sumber terlebih dahulu dimasukkan ke dalam media yang digunakan untuk isolasi protein. Protein akan menjadi ekstraseluler (diproduksi di luar sel) atau intraseluler (diproduksi di dalam sel).

Jika ekstraseluler, komponen seluler harus dipisahkan dan protein harus diisolasi. Sebaliknya, jika protein ada di dalam sel, metode yang berbeda diterapkan terlebih dahulu dengan mengganggu sel dan mengisolasi protein. Namun, jenis sel menawarkan variasi dalam metode.

Sel hewan mudah dipecah dan diisolasi proteinnya karena tidak memiliki dinding sel. Sel bakteri sangat kecil sehingga dapat dipecah dengan menggunakan lisozim atau teknik tekanan tinggi. Sel jamur dan tumbuhan mengandung dinding sel yang kaku. Oleh karena itu, kerusakan sel memerlukan metode yang lebih keras untuk mengisolasi protein intraseluler.

Ketika molekul protein diisolasi dalam medium, ini dapat dimurnikan dengan mengikuti beberapa teknik fisikokimia.

Selain itu, untuk isolasi protein hasil rekayasa genetika, protein tersebut ditandai dengan molekul tertentu sehingga dapat memberikan ciri khusus pada protein yang diinginkan untuk diisolasi. Ini membantu memisahkan protein yang diinginkan dari kontaminan.

Namun, ­prasyarat untuk pemurnian dan karakterisasi protein apa pun adalah kemampuan untuk mendeteksi dan mengukur jumlah protein total dan protein yang diinginkan dalam bahan sumber. Skema pemurnian tipikal dapat dianalisis.

Konsentrasi protein dalam sampel dipantau menggunakan spektrofotometer UV dimana absorbansi diukur pada 280 nm. Ini adalah metode pemantauan protein yang cepat dan tidak merusak.

Namun, bioassay protein yang tidak diketahui juga dapat dilakukan karena lebih sensitif daripada uji kimia. Ini dilakukan dengan membandingkan protein yang tidak diketahui dengan protein standar yang diketahui.

Dalam beberapa kasus bioassay protein (misalnya insulin) adalah wajib. Langkah-langkah utama pemurnian protein dibahas di bawah judul berikut:

  1. Pemulihan Awal Protein :

Langkah awal pemurnian protein adalah pengumpulan jaringan tanaman dan hewan yang cocok, misalnya darah (untuk mendapatkan protein darah), kelenjar hipofisis (untuk mendapatkan hormon hipofisis), hati (untuk ekstrak hati), dll.

Umumnya, protein yang diisolasi dari jaringan tumbuhan dan hewan bersifat intraseluler. Selain itu, protein mikroba intraseluler diperoleh setelah pertumbuhan sel. Media pertumbuhan dilewatkan melalui filtrasi atau sentrifugasi, dan sel mikroba dikumpulkan.

Sel yang dipanen dipindahkan ke dalam air atau larutan penyangga yang sesuai. Kemudian sel-sel tersebut dipecah sehingga protein intraseluler harus dilepaskan dalam air atau buffer. Beberapa perhitungan produksi protein mikroba dan ukuran fermentor diberikan.

  1. Partisi Dua Fasa Berair :

Homogenat sel kasar mengandung puing-puing sel dan protein yang diinginkan. Homogenat sel diperlakukan dengan campuran bifasik dektron dan polietilen glikol (PEG). Akibatnya debris sel dipartisi oleh dextron ke fase bawah yang lebih polar dan padat dibandingkan fase atas.

Sedangkan lapisan atas adalah fase PEG yang kurang polar dan padat. Homogenat terlarut (misalnya protein) dipartisi ke dalam fase PEG teratas. Karenanya protein terlarut dan sisa-sisa sel secara efektif dipisahkan oleh dua fase PEG dan dekstran ini.

Saat melakukan partisi dua fase berair, hal-hal berikut harus dipertimbangkan:

(i) Lipid atau asam nukleat harus dihilangkan dari homogenat sel atau dihancurkan karena sebagai kontaminan dapat mengganggu tahap pemurnian berikutnya,

(ii) Asam nukleat dapat dihilangkan melalui pengendapan atau menggunakan nuklease, sedangkan lapisan lipid dihilangkan melalui wol kaca atau kain (memiliki pori yang sangat halus).

(iii) Protein yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif pada pH yang tepat, bahan penukar ion, dan kekuatan ionik karena protein menunjukkan muatan bersih positif, negatif, atau tanpa muatan.

Selain itu, ekstrak dipekatkan dengan menggunakan metode presipitasi, kromatografi penukar ion dan sentrifugasi ultra. Ekstrak semacam itu dapat digunakan dalam skala besar. Namun, muncul masalah memaksimalkan stabilitas protein. Oleh karena itu, beberapa pertimbangan harus dibuat untuk mencapai tujuan ini pada setiap langkah.

Upaya yang dilakukan ke arah ini harus (i) mempertahankan pH optimum dari larutan buffer yang dapat memberikan stabilitas maksimum pada protein, (ii) menggunakan inhibitor yang dapat menghambat aksi protease (enzim pendegradasi protein), (iii) mencegah agitasi atau penggunaan bahan kimia yang menghancurkan protein yang diinginkan.

  1. Peningkatan Pemurnian :

Metode produksi dan pemurnian protein di laboratorium pada kondisi optimum tidak dapat diskalakan untuk skala industri. Untuk produksi industri dalam skala besar ada beberapa hal yang perlu diperhatikan.

Ini adalah: (i) penggunaan bahan baku yang tersedia dengan biaya rendah dan pembeliannya dalam jumlah besar, dan (ii) peningkatan produksi protein untuk mengurangi biaya tenaga kerja.

Dengan meningkatkan langkah-langkah pemrosesan hilir dan mengikuti jaminan kualitas, sekitar 80% biaya produksi produk dapat dihemat. Poin-poin pertimbangan dari langkah-langkah peningkatan pemurnian protein lainnya adalah:

  1. Penggunaan bejana penampung dan pompa transfer yang terbuat dari stainless steel polypropylene (plastik) daripada kaca seperti yang digunakan di laboratorium
  2. Penggunaan bahan kimia dan material yang seharusnya tidak menyebabkan korosi
  3. Penggunaan bahan yang harus inert dan tahan terhadap korosi oleh bahan kimia lain yang tergabung
  4. Tidak ada pencucian logam beracun ke dalam produk
  5. Pengoperasian GMP oleh tanaman komersial telah dibahas dalam Buku Ajar Bioteknologi Kelas XI
  6. Persetujuan pengolahan hilir (dalam bentuk lisensi) oleh otoritas regulasi sehingga protein yang diinginkan (atau produk apa pun) dapat diproduksi dan dipasarkan karena telah dirancang secara khusus

(a) Produksi Protein Secara Massal:

Pemrosesan hilir untuk produksi dan pemurnian protein dalam jumlah besar telah diberikan. Protein hewani dan nabati dimurnikan dari sel/jaringannya mengikuti prosedur serupa.

(b) Pemurnian Protein Tingkat Tinggi:

Persiapan protein yang digunakan untuk tujuan terapeutik atau diagnostik memiliki tingkat kemurnian yang sangat tinggi. Protein semacam itu disebut persiapan orang tua. Padahal protein yang digunakan sebagai sediaan induk harus steril. Metode pengobatannya adalah dengan injeksi, infus atau implantasi.

  1. Metode Karakterisasi Protein :

Protein yang dimurnikan seperti di atas dicirikan kemurniannya. Teknik berikut digunakan untuk menentukan kemurnian protein yang diinginkan:

(i) Elektroforesis. Metode elektroforesis telah dibahas secara rinci dalam Buku Ajar Bioteknologi Kelas XI.

(ii) Sidik Jari Protein (Pemetaan Peptida):

Sebelumnya telah dijelaskan di Bagian 1.

(iii) Elektroforesis Dua Dimensi:

Lihat bagian sebelumnya.

(iv) Pengurutan Protein:

Hal tersebut telah dijelaskan dalam Buku Ajar Bioteknologi Kelas XI.

(v) Spektrometri Massa:

Pada tahun 1900, untuk pertama kalinya JJ Thomson memperkenalkan spektrometer massa yang menggunakan medan magnet dan listrik tetap untuk memisahkan ion dengan massa dan energi yang berbeda.

Dia menyadari bahwa partikel bermuatan berbeda dalam momentum berperilaku berbeda dalam medan listrik, dan menggunakan properti ini untuk pemisahan ion dengan massa yang berbeda.

Penggunaannya yang luas untuk penelitian di berbagai bidang ilmu biologi dimulai pada tahun 1980-an. Selama 1990-2000, spektrometri massa menjadi teknik penting untuk penelitian genomik dan proteomik yang mengarah pada Hadiah Nobel Kimia 2002 untuk JB Fenn dan K. Tanaka.

Dalam beberapa tahun terakhir, spektrometri massa telah menjadi alat penting untuk analisis genom dan proteom dalam berbagai bentuknya. Ia mampu mengidentifikasi dan mengkarakterisasi protein yang ada bahkan dalam picomoles (10 -12 ). Pada dasarnya ini adalah perangkat analitik yang terdiri dari tiga komponen utama berikut:

I. Sumber Pengapian:

Ini melibatkan ionisasi gas analit (molekul yang akan dianalisis) untuk diperiksa. Ketika molekul mendapatkan atau kehilangan muatan (melalui ejeksi elektron, protonasi atau deprotonasi), ion molekul dihasilkan.

  1. Penganalisa:

Ion-ion yang dihasilkan seperti di atas dipisahkan berdasarkan rasio massa terhadap muatan (m/z).

iii. Detektor:

Massa molekul ion yang dipisahkan ditentukan dari spektrum massa yang diperoleh setelah spektrometri massa analit.

Komponen dasar spektrometer massa diberikan pada. Untuk identifikasi, protein dipisahkan dari ekstrak kasar pada gel dua dimensi. Bintik-bintik protein dipotong dan kemudian digunakan sebagai pencarian spektrometri massa atau terfragmentasi menjadi peptida kecil.

Protein dipecah menjadi peptida oleh protease (misalnya trypsin). Peptida dipisahkan dengan menggunakan kromatografi cair (seperti afinitas pertukaran ion atau kromatografi kolom fase balik). Protein mudah diidentifikasi jika telah terfragmentasi menjadi peptida.

Prinsip kerja spektrometri massa adalah untuk membuat ion fase gas dari bimolekul bermuatan polar seperti peptida, protein atau asam nukleat. Sampel (M) mengalami ionisasi dalam sumber ionisasi setelah dimasukkan ke dalam spektrometri massa. Berat molekul lebih dari 1299 Dalton sampel menghasilkan beberapa ion bermuatan misalnya M+2H.

Ada banyak situs protein yang cocok yang mengalami protonasi. Semua atom nitrogen amida tulang punggung dan gugus amino rantai samping dapat terprotonasi. Molekul bermuatan adalah sekutu elektrostatik yang didorong ke penganalisa.

Atas dasar penganalisa rasio m/z memisahkan ion. Detektor mendeteksi ion dan mentransfer sinyal yang diterima ke komputer. Informasi disimpan dan diproses oleh komputer.

Analisis protein menggunakan spektrometri massa

Analisis protein akan sangat penting untuk memahami berbagai proses biologis di era pasca-genomik. Untuk mencapai tujuan ini, spektrometri massa banyak digunakan untuk:

  1. pengurutan peptida,
  2. identifikasi protein,
  3. ekspresi protein pada jaringan dan kondisi yang berbeda
  4. identifikasi dan modifikasi pasca-transkripsi (misalnya fosforilasi, glikosilasi, dll.) protein sebagai respons terhadap rangsangan yang berbeda, dan
  5. karakterisasi interaksi protein yang meliputi interaksi protein-ligan, protein-protein dan interaksi protein-DNA

Peningkatan MS baru-baru ini telah meningkatkan penerapannya secara signifikan dalam studi struktur dan fungsi protein.

Metode Ionisasi:

MS mensyaratkan bahwa molekul yang akan diperiksa harus dalam bentuk ion gas. Ada beberapa metode yang tersedia untuk ionisasi biomolekul tetapi MALDI dan electrospray (ES) masing-masing digabungkan dengan TOF-MS dibahas di bawah ini:

Desorpsi-ionisasi Lapisan Berbantuan Matriks (MALDI):

MALDI pertama kali dikembangkan oleh Karas dan Hillenkamp pada tahun 1988. Ini bersama-sama mengendapkan bahan matriks dengan molekul analit.

Dalam metode ini sub-mikroliter campuran (matriks + analit) dipipet ke substrat logam dan dibiarkan kering. Campuran kering diiradiasi dengan pulsa laser (337 nm) yang secara khusus menyerap padatan matriks yang dipilih. Iradiasi menyebabkan transfer energi dan desorpsi menghasilkan fase gas

(vi) Desoption-Ionisasi Laser yang Disempurnakan Permukaan (SELDI):

Ini adalah kombinasi unik dari kromatografi afinitas dan waktu spektrometri massa penerbangan (TOF) pada platform tunggal, kombinasi yang ditunjuk sebagai SELDI-TOF MS (waktu desopsi-ionisasi laser yang ditingkatkan permukaan dari spektrometri massa penerbangan).

Sistem ini memungkinkan penangkapan protein, pemurnian, ionisasi, dan analisis campuran biologis kompleks secara langsung pada permukaan susunan chip protein dan deteksi protein yang dimurnikan dengan analisis MS desorpsi-ionisasi laser time of flight (LDI-TOF).

Sistem SELDI terdiri dari tiga bagian: (i) susunan chip protein (delapan titik berdiameter 2 mm), (ii) pembaca chip protein (LDI-TOF MS), dan (Hi) perangkat lunak khusus.

(vii) Ionisasi Elektrospray (ESI):

Pada akhir 1980-an, JB Fenn mengembangkan spektrometri massa ESI dan dianugerahi Hadiah Nobel pada tahun 2002 di bidang kimia. Dalam metode ini sampel dilarutkan dalam cairan dengan fase gerak (yaitu air: asetonitril: metanol) dan dipompa melalui jarum suntik dengan tegangan tinggi (sekitar 4.000 V yang menimbulkan medan listrik yang kuat di bagian atas nosel jarum logam).

Ini menyebarkan elektrostatis atau elektrospray tetesan kecil bermuatan tinggi berukuran sekitar satu mikrometer. Tetesan ini secara elektrostatis tertarik ke saluran masuk MS. Gas kering atau panas diterapkan.

Analisis berbagai molekul termasuk protein, oligonukleotida, gula dan lipid. Karena MS mengukur m/z, ini memungkinkan protein dengan berat molekul tinggi dapat diamati pada peralatan rentang massa rendah. Jadi ESI menghasilkan banyak molekul bermuatan. Fenomena ini telah ditunjukkan pada. Peptida atau protein diidentifikasi berdasarkan rasio m/z.

Rasio m/z ion dianalisis setelah pembentukannya. Protein baru dengan proyek Sequencing genom manusia dapat diidentifikasi melalui kombinasi MS dan genomik, dan juga menggunakan alat ‘Bioinformatika’.

Related Posts